Quando a detetive Rebecca Madsen (Sarah Jones) é designada para investigar um homicídio macabro, uma digital a leva até um suspeito improvável: Jack Sylvane (Jeffrey Pierce), um ex-detento de Alcatraz, que morreu décadas atrás. Quando suas buscas são impedidas pelo agente do governo Emerson Hauser (Sam Neill), ela procura ajuda de um especialista nos casos de Alcatraz, e entusiasta dos quadrinhos, Dr. Diego Soto (Jorge Garcia). Logo eles descobrem que Sylvane não só está vivo, mas à solta nas ruas de San Francisco, deixando um rastro de corpos, e sem envelhecer. Mas isso é apenas uma pequena parte de uma grande e sinistra conspiração que eles precisam deter a qualquer custo.

Larry Daley, o ex-guarda noturno do Museu de História Natural, agora é um sucesso empresarial. Mas, logo depois de ficar sabendo que seus amigos do museu foram enviados para o Museu Smithsonian, Larry recebe um telefonema desesperado de Jedediah, avisando que quatro dos maiores vilões da história voltaram à vida e planejam tomar o Smithsonian, e depois o mundo. Larry se junta a velhos e novos amigos para deter os planos diabólicos.

Quando Larry Daley é contratado como guarda noturno no museu, ele logo descobre que todos os seres do museu ganham vida após o pôr-do-sol. Logo de cara, Larry se vê frente a frente com um brincalhão esqueleto de T. Rex, mas também é cercado por exércitos de minúsculos soldados romanos e por caubóis armados. Para completar, há um macaquinho endiabrado que o deixa maluco! Mas talvez ele consiga descobrir um modo de controlar o caos e tornar-se um herói aos olhos de seu filho.